Sequenziamento - genotyping - Pcr Real Time
- Le convenzioni possono essere stipulate con tutti gli altri enti pubblici e privati, comprese altre università italiane. Sono veri contratti che regolano i rapporti e che permettono di svolgere l'attività di ricerca o supporto, impiegando definite risorse umane e strumentali, necessarie al raggiungimento dell'obiettivo della ricerca. Nello specifico sia per i servizi a tariffa che in convenzione noi ci occupiamo di:
SEQUENZIAMENTO DIRETTO
L’utente deve fornire un frammento PCR, opportunamente purificato per sequenziamento ie il primer desiderato in un volume finale di 10 µl TOTALI.
Per la purificazione esistono svariate metodiche che però possono influire sul risultato finale. La quantità di prodotto stampo necessaria va calcolata in 10ng ogni 100pb di lunghezza di frammento PCR, mentre per i plasmidi vi consigliamo di contattarci (variando in base a tipologia e dimensione). Per i primer si possono utilizzare i normali primer Desalt non HPLC raramente si incontrano problemi di n-1. Per la spedizione ci dovete fornire 5µl di DNA purificato e 5µl di primer 5pmol/µl (5µM), in un volume totale di 10 µl. Si possono variare le concentrazioni in base alle concentrazione del primer (esempio: 8,75µl DNA +1,25µ di primer 20µM). I risultati saranno inviati tramite e-mail in 3gg lavorativi successivi all’arrivo dei campioni.
PURIFICAZIONE E SEQUENZIAMENTO
Il centro provvede alla purificazione, quantificazione e sequenziamento di frammenti PCR. La richiesta deve essere accompagnata da foto dei frammenti PCR nitida, su gel di agarosio al 1,5% e con SizeMarker di riferimento. Il primer a concentrazione 10-20µM deve essere fornito separatamente. I risultati saranno inviati tramite e-mail in 4gg lavorativi successivi all’arrivo dei campioni.
PROGETTI CUSTUM DI ESTRAZIONE, AMPLIFICAZIONE, PURIFICAZIONE E SEQUENZIAMENTO del DNA
Sono pacchetti di analisi che prevedono tutte le fasi di una normale processo di analisi classiche, dall’estrazione del DNA fino all’analisi della sequenza nucleotidica ottenuta. Tale pacchetti sono condizionati da offerte dedicate e necessitano di tempistiche maggiori (disponibili sotto forma di KitCodeSeq, KitPCRSeq).
DIMENSIONAMENTO DI FRAMMENTI DI DNA (SSR, ISSR, AFLP, SNPs)
Separazione mediate elettroforesi capillare di frammenti di PCR opportunamente marcati con molecole fluorescenti, in base alla loro lunghezza. I costi di analisi variano in ragione del numero dei campioni, sono inclusivi di buffer di corsa e size standard oltre che il supporto per la corretta diluizione. Nelle sedi del centro sono disponibili postazioni di analsi dove poter utilizzare il software GeneMapper gratuitamente. Su offerta forniamo il servizio di lettura dei dati e realizzazione della matrice allelica.
I fluorofori utilizzabili sono:
Set fluorofori |
Fluorofori utilizzabili |
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Virtual Filter SET D |
6Fam - Hex (o Vic) - Ned (o Tamra) - Rox |
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Virtual Filter SET G5v2 |
6 Fam - Vic ( o Hex)- Ned (o Tamra) - Pet - Liz |
Per le analasi di RealTime PCR e Gene Expression abbiamo in dotazione una Real Time PCR ABI 7300, si può accedere al servi per la semplice corsa di piastre da 96 precast, in questo caso l’utente può accedere direttamente al centro per provvedere alla preparazione della reazione e alla corsa. Oppure dietro acconrdo con il centro pensiamo Noi all'allestimento sperimentale e analisi dei dati. Nel nostro laboratorio è possibile effettuare analisi di frammenti per esami forensi.
Lo strumento permette la lettura di 3 fluorofori simultaneamente (in multiplex) utilizzando un riferimento passivo (Il ROX) per eliminare la fluorescenza di fondo. I fluorofori che possono essere letti sono: 6Fam, Joe, Ned, Tambra, Vic e Sybergreen.
Le analisi più comuni sono la quantificazione assoluta e relativa di DNA, l'High Resolution Melting dei frammenti di DNA e la Discriminazione allelica (SNPs).
CONVENZIONI E PROGETTI
Su progetto possiamo sviluppare diverse applicazioni quali: saggi enzimatici molecolari per patogeni (Flescenza Dorata della Vite) identificazione di OGM (Collaborazioni con ARPAT regione Toscana) analisi di lieviti (Brettanomyces nel vino), Analisi RTPCR per verifica RADseq, HRM screening di SNPs, etc.
Ultimo aggiornamento
04.04.2022