Progetti e Convenzioni Progetto IMERA

Idrogeno e MEtano da Residui dell’Agroindustria

Descrizione della ricerca 

 

Stato dell'arte specifico

I substrati, su cui le comunità microbiche si possono sviluppare, sono assai numerosi. In questi sistemi, la materia organica complessa viene convertita in un ampia gamma di composti intermedi con produzione finale di CH4 e CO2. Infatti, prima i microrganismi idrolitici rendono solubili composti insolubili complessi (carboidrati, grassi e proteine) della materia organica, successivamente questi composti intermedi solubili vengono convertiti in idrogeno ed acidi organici da microrganismi, che possono essere fotosintetici o non-fotosintetici, che possono agire singolarmente od in consorzi (di tipi simili) o come comunità eterogenee. Infine altri microrganismi, chiamati metanogeni, convertono gli acidi organici in metano e diossido di carbonio.E' evidente quindi che nel processo di digestione anaerobica i ruoli che i differenti membri delle comunità microbiche svolgono sono diversi. Di conseguenza comprendere la struttura della comunità diventa un obiettivo importante per poter operare sulla comunità stessa e rendere il processo di digestione più efficiente.I metodi per l'analisi della struttura delle comunità microbiche in genere si distinguono in metodi coltura-dipendenti e metodi coltura-indipendenti. I tradizionali metodi coltura dipendenti consentono la caratterizzazione e l'isolamento di microrganismi che possono crescere su mezzi di coltura. D'altra parte circa il 99% dei microrganismi presenti nell'ambiente non possono essere messi in coltura e rimangono ancora non caratterizzati (Amann et al., 1995). Approcci coltura-indipendenti, invece consentono di analizzare la struttura dei consorzi microbici indipendentemente dalla capacità dei differenti microrganismi di crescere in coltura (You et al., 2000; van der Gucht et al., 2005).Mediante tecniche di analisi molecolare basate sull'amplificazione del rDNA 16S, sono stati identificati numerosi microrganismi capaci di produrre idrogeno dai carboidrati. Questi ultimi sono i principali composti organici di tutta la biomassa e, quindi, rappresentano un substrato chiave nella produzione di idrogeno. Da un lavoro di Fang e collaboratori (2002a), che analizzava le specie microbiche presenti in una coltura per la produzione di idrogeno da glucosio mediante analisi di una libreria del gene 16S rRNA, risulta che il 64,4% dei cloni presenti appartenevano alla famiglia Clostridiaceae. Il 43,8% di questi presentava elevata similarità con Clostridium cellulosi, il 12,5% con Clostridium acetobutyl e l'8,3% con Clostridium tyrobutyricum. Invece il 18,8% dei cloni apparteneva alla famiglia Enterobacteriaceae e il 3,1% presentava elevata similarità con Streptococcus bovis. Nella produzione di idrogeno mediante fermentazione butirrica di fanghi granulosi invece, il 69% dei cloni era distribuito tra quattro specie del genere Clostridium ed il 13,5% presentava elevata similarità con Sporolactobacillus racemicus del gruppo Bacillus/Staphylococcus (Fang et al., 2002b).Altri batteri produttori di idrogeno presenti nel fermentato acidogenico ottenuto da residui alimentari, sono stati individuati da Shin e colleghi (2004) ed essi sono Thermoanaerobacterium thermosaccharolytium e Desulfotomaculum geothermicum in condizioni di termofilia ed un ceppo appartenente all'ordine Thermotogales e batteri appartenenti al genere Bacillus in condizioni di mesofilia. In un recente lavoro, Ren e collaboratori (2007) hanno analizzato i cambiamenti nelle comunità microbiche attive durante tre differenti processi di fermentazione di acque reflue ad alto contenuto di composti organici condotti a tre diversi valori di pH. Le popolazioni dominanti individuate nelle comunità presenti nei tre reattori erano formate da batteri Gram-positivi a basso contenuto in GC, da batteri del genere Bacterioides, da -Proteobacteria e Actinobacteria. D'altra parte in ciascun reattore sono stati individuati ceppi batterici caratteristici. In particolare le comunità microbiche che determinano i processi di fermentazione acido-mista ed etanolica erano composte da un elevato numero di ceppi differenti ed erano ricche di isolati appartenenti ai generi Ethanoligenens, Acetanaerobacterium, Clostridium, Megasphaera, Citrobacter e Bacterioides.I metanogeni invece sono Archaea che possono essere distinti in metanogeni acetoclasti e metanogeni idrogenotrofi. I primi appartengono all'ordine dei Methanosarcinales che comprende due famiglie, i Methanosaetaceae che utilizzano solo acetato e i Methanosarcinaceae che utilizzano sia acetato sia composti metilici e idrogeno. I secondi appartengono ai restanti quattro ordini, i Methanobacteriales, i Methanococcales, i Methanomicrobiales ed i Methanopyrales, che utilizzano solo idrogeno ed anidride carbonica o formato per la produzione di metano (Boone e Castenholz, 2001). E' poco probabile però che i metanogeni appartenenti all'ordine dei Methanopyrales siano presenti nei processi anaerobici a causa del fatto che hanno un temperatura di crescita molto alta (>80 °C), mentre un ruolo importante nel processo di metanazione è svolto dai metanogeni acetoclasti (infatti più del 70% di metano si forma dall'acetato nei sistemi anaerobici).Anche l'analisi dei consorzi di metanogeni può essere effettuata con tecniche molecolari ed in particolare mediante analisi del 16S rDNA. Ad esempio, in un'analisi di campioni prelevati in un digestore di reflui fangosi è risultata elevata la presenza di metanogeni appartenenti all'ordine dei Methanosarcinales e dei Methanomicrobiales, mentre non è stata rilevata la presenza di Methanobacteriales (Chouari et al., 2005). I Methanobacteriales però rappresentano la popolazione dominante nei digestori di rifiuti solidi urbani sia operanti in condizione di mesofilia che operanti in condizioni di termofilia, ma non nei digestori di residui fangosi. I Methanosarcinales sono abbondanti nei digestori di rifiuti solidi urbani e nei digestori di residui fangosi che operano in condizioni di mesofilia ma non nei digestori di rifiuti solidi urbani operanti in condizioni di termofilia (Raskin et al., 1994). In particolare i Methanosaetaceae sono la popolazione dominante nei digestori in cui vengono trattati i residui di distillazione del vino (Godon et al., 1997). Infine sulla base dell'analisi delle sequenze del gene 16S rRNA è stato anche possibile individuare la presenza, in campioni prelevati in un digestore di reflui fangosi, di un nuovo gruppo di Archaea le cui sequenze (Chouari et al., 2005) clusterizzano in un gruppo monofiletico distinto e vicino all'ordine Methanobacteriales (Watanabe et al., 2002).

 

Obiettivi specifici

 

Obiettivi specifici delle attività in cui sarà impegnata questa unità operativa sono:- analisi del profilo delle comunità microbiche coinvolte nei processi di produzione di idrogeno e di metano mediante costruzione ed analisi di librerie del gene 16S rRNA;- coordinamento del network progettuale anche mediante l'uso del proprio sito web;- garantire la corretta scansione dei tempi progettuali;- elaborare una brochure di progetto.

 

Piano di attività

 

L'U.O. CIBIACI, coinvolta nelle attività sperimentali della Linea 1, procederà alla caratterizzazione molecolare della comunità microbica operante nei processi di produzione di idrogeno e biometanazione a partire dal DNA totale estratto da campioni del liquor di fermentazione prelevati a tempi diversi da ciascuno dei due reattori di processo. Il preparato di DNA verrà usato come stampo per l'amplificazione PCR del gene del rRNA 16S con primer specifici per batteri ed Archaea. I prodotti di amplificazione verranno inseriti in un vettore plasmidico, che verrà utilizzato per trasformare cellule competenti di Escherichia coli in modo da ottenere librerie genomiche di rDNA 16S. In particolare verranno costruite 6 librerie da PCR indipendenti per ciascun preparato di DNA e successivamente per ciascuna libreria verranno selezionate 30 colonie, contenti il frammento di dimensioni attese. I frammenti PCR clonati verranno sequenziati con un sequenziatore automatico. Le sequenze ottenute verranno analizzate mediante confronto con i dati presenti in database pubblici e mediante la costruzione di alberi filogenetici con specifici software.

 

Articolazione temporale delle attività

 

- Dal mese 0 al mese 36: coordinamento del network progettuale anche mediante l'uso del proprio sito web.- Dal mese 0 al mese 36: coordinamento delle attività per garantire la corretta scansione dei tempi progettuali.- Dal mese 6 al mese 12: messa a punto di metodi di estrazione e di analisi.- Dal mese 12 al mese 24: estrazione del DNA.- Dal mese 14 al mese 26: amplificazione PCR del gene 16S rRNA e clonaggio in vettori plasmidici.- Dal mese 16 al mese 30: sequenziamento dei frammenti clonati e analisi filogenetica dei risultati.- Dal mese 32 al mese 34: elaborazione e stampa di una brochure di progetto.

 

Ostacoli prevedibili ed azioni correttive

 

Difficoltà di interazione tra i partner dovuta alla diversa localizzazione operativa da superare con incontri semestrali presso il C.I.B.I.A.C.I. di tutte le UO. Difficoltà nello scambio di campioni da superare utilizando i corrieri espressi capaci di garantire il trasporto di materiale a temperature di congelamento.

 

Risultati attesi

 

I risultati dell'analisi filogenetica delle sequenze ottenute consentiranno di descrivere analiticamente la struttura delle comunità operanti nei processi di produzione di idrogeno e di biometanazione.

 

Ricadute e benefici

 

La caratterizzazione della struttura delle comunità microbiche consentirà di stabilire se è necessario intervenire ed eventualmente in quale modo intervenire per ottimizzare le condizioni operative dei due processi che si svolgono nei reattori sperimentati nell'ambito della Linea 1.

 

Collaborazioni esterne 

La U.O. CIBIACI-UNIFI ricorrerà, a titolo di consulenza esterna, alla collaborazione con la società Studio Italia S.r.l di Rimini. Studio Italia S.r.l. ha svolto numerosi incarichi di consulenza tecnico-economica per enti pubblici e privati, consorzi, aziende agro-forestali, industrie alimentari e associazioni di categoria, collaborando a progettualità e studi di settore in ambito agro-industriale a carattere regionale, nazionale ed europeo. Negli ultimi anni Studio Italia Srl ha sviluppato una notevole esperienza nel settore delle tecnologie innovative per la produzione di energia da fonti rinnovabili, con particolare attenzione nel creare un rapporto d'equilibrio tra sostenibilità ambientale ed economica. Ha collaborato all'elaborazione di numerosi progetti sulle bioenergie tra cui il Contratto di filiera per le energie rinnovabili di CO.AGR.ENERGY (Consorzio per lo sviluppo delle agro-energie) e a molteplici progetti di ricerca tra cui il Progetto "ANAEROBIO" (finanziato dalla Regione Toscana) finalizzato all'ottimizzazione dei processi per la produzione di biogas da biomasse vegetali e scarti agro-industriali. Nell'ambito del progetto IMERA, Studio Italia attuerà prestazione di carattere scientifico e tecnico, indagini di mercato e analisi del territorio, caratterizzazione agronomica delle biomasse coltivate o di materiali di scarto delle lavorazioni agro-industriali utilizzate, l'elaborazione del piano di fattibilità di impianto industriale funzionante calcolo dei bilanci economici dei processi studiati.