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CIBIACI - Centro Interdipartimentale di Servizi per le Biotecnologie di interesse Agrario, Chimico, Industriale

Sequenziatori Automatici ABI 310

 

 

Permettono l'analisi di sequenza dei frammenti di DNA con la tecnologia dei BigDyes Terminator e il Genotyping.

 

I 2 sequenziatori in dotazione presso il Centro sono gli ABI prism 310 CE systems. Sequenziatori monocapillari che utilizzano la tecnologia dell’elettroforesi capillare unita ad un analizzatore di fluorescenza. La metodica utilizzata per marcare il DNA è un’evoluzione del metodo di Sanger che Applied Biosystems commercializzata in Kit per il sequenziamento (nel nostro caso BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit v1.1). Dopo la reazione di sequenza e la purificazione dai Big Dyes non incorporati (come da protocollo Applied Biosystems) il campione viene caricarto sul seqeunziatore e separato nel capillare nei diversi frammenti con un polimero particolare POP6 adatto alla separazione di frammenti di sequenza. Un software (Sequencing Analisys) analizza il dato grezzo e produce un elettroferogramma in formato leggibile ABI.

Analisi Sequenza

Frammenti di DNA prodotti da PCR o clonati in plasmidi sono sequenziabili facilmente.

I frammenti devono essere opportunamente purificati da: sali, nucleotidi, primer e bande accessorie per poter ottenere una efficiente reazione di Sequenza (purificazione DNA).

Il DNA così trattato viene utilizzato per la reazione di sequenza.

Segue una ulteriore purificazione dai BigDyes non incorporati, dopodichè è possibile separare mediante elettroforesi capillare i frammenti marcati.

Il software sequencing analisys permette l'analisi del dato, l'editing e poi la visualizzazione finale della sequenza.

Il file della sequenza con il cromatogramma viene spedito per posta elettronica ed è possibile visualizzarlo attraverso piccoli programmi che permettono anche l'editing (Chromas - EditView - FinchTV). 

Analisi di Frammenti

Sono analizzabili frammenti di DNA con lunghezza tra 35 e 500 pb; i risultati si riferiscono a marcatori molecolari quali: microsatelliti, sNPS, AFLP, TRFLP, SSCP (a progetto) e corse di frammenti per Analisi Forense.

 
ultimo aggiornamento: 02-Gen-2018
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